ความละเอียดของไขมันในเซลล์ที่มีชีวิต: ความก้าวหน้าครั้งใหม่ในกล้องจุลทรรศน์โฟโตอะคูสติกอินฟราเรดกลางไฮเปอร์สเปกตรัม

ไขมันไม่เพียงแต่เป็นส่วนประกอบโครงสร้างของเยื่อหุ้มเซลล์และโมเลกุลกักเก็บพลังงานเท่านั้น แต่ยังเกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับการเกิดและการพัฒนาของมะเร็ง โรคอ้วน เบาหวาน โรคหัวใจและหลอดเลือด และโรคเกี่ยวกับความเสื่อมของระบบประสาท อย่างไรก็ตาม การสังเกตและแยกแยะไขมันประเภทต่างๆ ในเซลล์ที่มีชีวิตโดยตรงนั้นต้องเผชิญกับความท้าทายทางเทคนิคมายาวนาน วิธีการติดฉลากฟลูออเรสเซนต์แบบดั้งเดิมนั้นถูกจำกัดด้วยประสิทธิภาพ ความจำเพาะ และการรบกวนที่อาจเกิดขึ้นกับการทำงานของเซลล์ ในขณะที่เทคนิคการมองเห็นแบบไร้ฉลากมักจะประสบปัญหาในการแยกแยะโมเลกุลไขมันที่มีโครงสร้างทางเคมีคล้ายคลึงกัน

Nature Methods ได้ตีพิมพ์ผลการศึกษาที่แนะนำเทคโนโลยีที่เรียกว่า "Hyperspectral Fingerprint-region Photoacoustic Microscopy" (hyFOPM) ด้วยการใช้โหมดการสั่นสะเทือนแบบพันธะเดี่ยวในบริเวณลายนิ้วมือช่วงกลางอินฟราเรด เทคโนโลยีนี้ช่วยให้การตรวจจับแบบไร้ฉลากและการสร้างภาพแบบไดนามิกของสฟิงโกไมอีลิน (SM) และคอเลสเตอรอล (Chol) ในเซลล์ที่มีชีวิต

หลักการทางเทคนิค
วิธีการออปติคัลแบบไร้ฉลากส่วนใหญ่อาศัยสัญญาณในบริเวณการสั่นสะเทือนที่ยืดออกของ CH (ประมาณ 2800–3,000 ซม. ⁻ ¹ ) แต่แถบสเปกตรัมในภูมิภาคนี้มีความคล้ายคลึงกันอย่างมากในไขมันต่าง ๆ ทำให้ยากต่อการแยกแยะระหว่างประเภทต่างๆ ในทางตรงกันข้าม บริเวณลายนิ้วมือช่วงอินฟราเรดตอนกลาง (900–1730 ซม.⁻¹) มีข้อมูลการสั่นสะเทือนของพันธะเดี่ยวมากกว่า ซึ่งสะท้อนถึงโครงสร้างเฉพาะของโมเลกุล เช่น การดูดซับลักษณะเฉพาะของพันธะเอไมด์ พันธะเอสเตอร์ และวงแหวนสเตียรอยด์

การออกแบบระบบ hyFOPM มีศูนย์กลางอยู่ที่แนวคิดนี้ ใช้เลเซอร์ควอนตัมคาสเคดที่ปรับได้เป็นแหล่งกระตุ้น ครอบคลุมช่วง 900–2932 cm⁻¹ ด้วยความละเอียดสเปกตรัม 2 cm⁻¹ พัลส์เลเซอร์จะกระตุ้นตัวอย่างเพื่อสร้างสัญญาณโฟโตอะคูสติก ซึ่งตรวจพบโดยทรานสดิวเซอร์อัลตราโซนิกเพื่อสร้างภาพไฮเปอร์สเปกตรัม ระบบมีความละเอียดเชิงพื้นที่ประมาณ 4.3 μm ทำให้สามารถถ่ายภาพในระดับเซลล์ที่มีชีวิตได้

การตรวจสอบความถูกต้องของแบบจำลองไขมัน
เพื่อตรวจสอบความเป็นไปได้ของเทคโนโลยี ทีมวิจัยได้เตรียมแบบจำลองสารละลายไขมันสองมิติที่ประกอบด้วยคอเลสเตอรอล (Chol) ฟอสฟาติดิลโคลีนไม่อิ่มตัว (DOPC) และสฟิงโกไมอีลิน (SM)

(1) การเปรียบเทียบคุณสมบัติสเปกตรัม

สเปกตรัมบริเวณลายนิ้วมือที่รวบรวมโดย hyFOPM มีความสอดคล้องอย่างมากกับผลลัพธ์ ATR-FTIR ไขมันทั้งสามชนิดมีพีคสเปกตรัมที่แตกต่างกัน: คอเลสเตอรอลนำเสนอพีคการดูดซึมที่แข็งแกร่งสำหรับการเปลี่ยนรูปวงแหวนสเตียรอยด์ที่ 1,056 ซม.⁻¹; DOPC มีการสั่นสะเทือนแบบยืดออกของ C=O ของกลุ่มเอสเทอร์ที่ 1731 cm⁻¹; และสฟิงโกไมอีลินสอดคล้องกับแถบเอไมด์ I, แถบเอไมด์ II และการสั่นสะเทือนด้วยการดัดงอของกรดไขมัน CH₂ ที่ 1645 cm⁻¹, 1555 cm⁻¹ และ 1464 cm⁻¹ ตามลำดับ

(2) ความสามารถในการแยกสเปกตรัมและการจำแนกประเภท
เมื่อใช้หมายเลขคลื่นเพียง 15 หมายเลขในบริเวณลายนิ้วมือเพื่อแยกการผสมเชิงเส้น crosstalk ระหว่างคอเลสเตอรอลและสฟิงโกไมอีลินจะใกล้เคียงกับ 0% ในขณะที่ crosstalk สำหรับ DOPC คือ 23% ในทางตรงกันข้าม crosstalk จะเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อใช้เลขคลื่น 7 ตัวในบริเวณที่ยืด CH การใช้งานการวิเคราะห์จำแนกเชิงเส้น (LDA) เพิ่มเติมแสดงให้เห็นว่าความแม่นยำในการจำแนกประเภทโดยเฉลี่ยสูงถึง 96% เมื่อใช้บริเวณลายนิ้วมือหรือบริเวณ CH และสูงถึง 97% เมื่อใช้หมายเลขคลื่นทั้งหมด

(3)โมเดล Giant Unilamellar Vesicle (GUV)
การศึกษาได้เตรียม GUV สามประเภทเพื่อจำลองเยื่อหุ้มเซลล์: โมเดล 1 ซึ่งเป็นส่วนผสม 1:1 ของ SM และ Chol ซึ่งสร้างเมมเบรนที่มีคำสั่งหนาแน่น โมเดล 2 ซึ่งเป็นส่วนผสมของ DOPC, SM และ Chol ในอัตราส่วน 2:2:1 อยู่ร่วมกันในเฟสที่เรียงลำดับของเหลวและผิดปกติของของเหลว และแบบจำลอง 3 DOPC บริสุทธิ์ สร้างเมมเบรนของเหลวที่ไม่เป็นระเบียบ ภาพที่ได้มาโดย hyFOPM ที่ 2852 cm⁻¹ มีความสอดคล้องทางสัณฐานวิทยากับภาพที่ได้จากการย้อมสีฟลูออเรสเซนต์ Nile Red ลักษณะสเปกตรัมของตุ่มต่างๆ สอดคล้องกับลิพิดบริสุทธิ์ ซึ่งยืนยันว่าสามารถระบุส่วนประกอบแต่ละส่วนในเมมเบรนผสมได้

(4) การใช้งานการควบคุมคุณภาพ
ทีมวิจัยพบว่าองค์ประกอบไขมันที่แท้จริงเบี่ยงเบนไปจากอัตราส่วนเป้าหมาย (ความคลาดเคลื่อนประมาณ 40%) โดยทำการวัดสเปกตรัมบน GUV ที่แตกต่างกัน 10 ชนิดสำหรับแต่ละประเภท และวางแผนแผนภาพเฟสแบบไตรภาค สิ่งนี้บ่งชี้ว่าสามารถใช้ hyFOPM สำหรับการประเมินคุณภาพในการเตรียม GUV

การประยุกต์ในเซลล์ที่มีชีวิต
การศึกษาเพิ่มเติมได้นำ hyFOPM ไปใช้กับเซลล์ที่มีชีวิต โดยสังเกตการเปลี่ยนแปลงแบบไดนามิกของสฟิงโกไมอีลินและโคเลสเตอรอลในแบบจำลองเซลล์สองเซลล์ตามลำดับ

(1) การสะสมสฟิงโกไมอีลินในเซลล์ A549
เซลล์มะเร็งของต่อมในปอดของมนุษย์ (A549) ได้รับการบำบัดด้วยกรด 2-ไฮดรอกซีโอเลอิก (2-OHOA) ซึ่งเป็นสารประกอบต้านเนื้องอก ซึ่งคาดว่าจะทำให้เกิดการสะสมของสฟิงโกไมอีลิน สเปกตรัมของขอบเขตลายนิ้วมือ (1600–1400 ซม.⁻¹) ถูกรวบรวมจาก 50 เซลล์ แสดงให้เห็นว่าพื้นที่จุดสูงสุด 1464 ซม.⁻¹ เพิ่มขึ้น 117% หลังการรักษา เทียบกับเพียง 23% ในกลุ่มควบคุมในช่วงเวลาเดียวกัน ต่อมา การถ่ายภาพได้ดำเนินการกับเซลล์ 3000 เซลล์โดยใช้หมายเลขคลื่นเพียงสี่หมายเลข (2852 cm⁻¹ สำหรับไขมันทั้งหมด, 1540 cm⁻¹ สำหรับโปรตีนเอไมด์ II, 1464 cm⁻¹ สำหรับสฟิงโกไมอีลิน และ 1,048 cm⁻¹ สำหรับคอเลสเตอรอล) ผลการวิจัยพบว่าสัญญาณสฟิงโกไมอีลินเพิ่มขึ้นอย่างต่อเนื่องที่ 48 และ 72 ชั่วโมงหลังการรักษา ในขณะที่สัญญาณคอเลสเตอรอลไม่มีการเปลี่ยนแปลงที่มีนัยสำคัญ

(2) การโหลดคอเลสเตอรอลในเซลล์ HEK
เซลล์ไตของตัวอ่อนมนุษย์ (HEK293) ได้รับการบ่มร่วมกับ methyl-β-cyclodextrin-cholesterol complex (MβCD-Chol) เพื่อเพิ่มคอเลสเตอรอลในเยื่อหุ้มเซลล์ สเปกตรัมบริเวณลายนิ้วมือของเซลล์ 50 เซลล์แสดงให้เห็นว่าพื้นที่จุดสูงสุด 1,048 ซม.⁻¹ เพิ่มขึ้น 161% หลังการรักษา ในขณะที่จุดสูงสุด 1,464 ซม.⁻¹ สำหรับสฟิงโกไมอีลินลดลงเล็กน้อย ซึ่งสอดคล้องกับคุณสมบัติที่ทราบกันว่าไซโคลเดกซ์ทรินสกัดไขมันของเยื่อหุ้มเซลล์บางส่วนในขณะที่ส่งโคเลสเตอรอล การถ่ายภาพหลายคลื่นของเซลล์ 3,000 เซลล์ยังยืนยันการยกระดับของสัญญาณคอเลสเตอรอล โดยเพิ่มขึ้นเล็กน้อยในสัญญาณไขมันทั้งหมดและการเปลี่ยนแปลงเล็กน้อยในสัญญาณโปรตีน

ความสำคัญและแนวโน้ม
การศึกษานี้แสดงให้เห็นถึงความสามารถในการแยกแยะโมเลกุลไขมันที่มีโครงสร้างทางเคมีคล้ายกันในเซลล์ที่มีชีวิตโดยไม่ต้องติดฉลาก เมื่อเปรียบเทียบกับวิธีการแบบดั้งเดิมที่ใช้การติดฉลากแบบฟลูออเรสเซนต์หรือไอโซโทป hyFOPM จะหลีกเลี่ยงปัญหาต่างๆ เช่น ประสิทธิภาพการติดฉลากและการรบกวนฟังก์ชันของเซลล์ และความสามารถในการเลือกสรรสามารถปรับให้เข้ากับลักษณะสเปกตรัมของไขมันเป้าหมายได้อย่างยืดหยุ่นโดยการปรับหมายเลขคลื่นการกระตุ้น

ความจำเพาะทางสเปกตรัมของระบบปัจจุบันในบริเวณลายนิ้วมือนั้นเหนือกว่าบริเวณที่ยืดออกของ CH ซึ่งเปิดโอกาสให้แยกแยะประเภทย่อยของไขมันได้มากขึ้น การศึกษายังชี้ให้เห็นว่าการผสมผสานเทคนิคการแยกสเปกตรัมขั้นสูง เช่น การเรียนรู้เชิงลึก คาดว่าจะปรับปรุงความไวและความจำเพาะเพิ่มเติมได้ นอกจากนี้ กล้องจุลทรรศน์โฟโตอะคูสติกอินฟราเรดกลางสามารถเข้าถึงความลึกของการถ่ายภาพมากกว่า 150 μm ในเนื้อเยื่อ และการใช้งานในอนาคตสามารถขยายไปยังตัวอย่างที่หนาหรือการตั้งค่า ในสิ่งมีชีวิต การเร่งความเร็วทางเทคโนโลยี (เช่น การสุ่มตัวอย่างสเปกตรัม) และการทำให้ระบบมีขนาดเล็กลงเป็นทิศทางสำคัญในการพัฒนาเทคโนโลยีนี้ไปสู่การวิเคราะห์ ณ จุดดูแลผู้ป่วยหรือการทดสอบในห้องปฏิบัติการตามปกติ